Laboratorium R&D

Oferowana usługa polega na określeniu mechanizmu działania cytotoksycznego, co ma szczególne znaczenie zwłaszcza w badaniach nad nowymi lekami przeciwnowotworowymi.

Zarówno apoptoza jak i nekroza mogą być efektem działania związków o charakterze cytotoksycznym. Apoptoza jest harmonijnym i zaprogramowanym mechanizmem planowej śmierci komórek występującym w wielu procesach fizjologicznych. Nekroza jest to patologiczny i niezorganizowany proces, który może powodować powstawanie silnych reakcji zapalnych. Dlatego też leki powodujące eliminację komórek niepożądanych w procesie nekrozy są mniej pożądane z klinicznego punktu widzenia. Na etapie wyboru nowych kandydatów na lek, ważne jest więc określenie występowania oraz mechanizmu ich działania cytostatycznego.

Analiza jest wykonywana przyżyciowo na komórkach dostarczonych przez Klienta w zawiesinie. Badanie mechanizmu obumierania komórek jest wykonywane za pomocą barwienia podwójnego z użyciem fluorescencyjnie znakowanej Aneksyny V (AnxV) i jodku propidyny (PI). Aneksyna V wiąże się specyficznie z fosfatydyloseryną znajdującą się na powierzchni komórek wchodzących na szlak apoptozy. Dodatkowo jodek propidyny pozwala na wybarwienie DNA komórek, których błona uległa uszkodzeniu, a więc nekrotycznych oraz na późnych etapach apoptozy. Zastosowanie obu barwników jednocześnie pozwala na określenie liczby komórek ulegających śmierci komórkowej oraz określenie proporcji pomiędzy jej mechanizmami. Dzięki takiemu podejściu możliwe jest określenie potencjału cytotoksycznego badanej substancji wraz z określeniem mechanizmu jej działania.

Analiza dystrybucji w cyklu komórkowym jest jednym z podstawowych narzędzi wykorzystywanych w badaniu sposobu funkcjonowania i kontroli tego procesu. Dostarcza też cennych informacji na temat mechanizmu działania potencjalnych leków przeciwnowotworowych nowej generacji, których zadaniem jest hamowanie proliferacji poprzez wpływanie na mechanizmy kontrolne cyklu komórkowego. Zastosowanie cytometrii przepływowej pozwala w szybki i wiarygodny sposób ocenić rozkład populacji w poszczególnych etapach cyklu.

LBBK oferuję usługę analizy cytometrycznej, w skład której wchodzi:

• Poddanie dostarczonej przez Klienta zawiesiny utrwalonych komórek obróbce w kierunku usunięcia RNA,
• Wybarwienie próbki jodkiem propidyny (PI), barwnikiem fluorescencyjnym wiążącym się z kwasami nukleinowymi w sposób ilościowy,
• Analiza ilościowa DNA znajdującego się w komórkach z wykorzystaniem cytometrii przepływowej,
• Określenie liczby komórek pozostających w poszczególnych fazach cyklu komórkowego (G0/G1, S, G2/M), a także komórek nietypowych – komórek apoptotycznych, dla których charakterystyczny jest ubytek DNA oraz komórek poliploidalnych.

Wynikiem analizy jest informacja o liczbie oraz proporcjach pomiędzy komórkami w poszczególnych fazach cyklu komórkowego w otrzymanej populacji komórek. Porównanie otrzymanych wartości pomiędzy danymi populacjami w różnych wariantach doświadczalnych może dostarczyć cennych informacji na temat mechanizmu oraz miejsca zatrzymania komórek w cyklu.

Charakterystyka multipotentnych komórek macierzystych może się różnić min. ze względu na różnice osobnicze oraz na miejsce pobrania materiału, z której są izolowane. Określenie drobiazgowej charakterystyki komórek wyizolowanych z danego materiału, jest niezbędne do określenia ich potencjału i zasadności wykorzystania w danych zastosowaniu (np. terapeutycznym, do regeneracji kości, chrząstki czy jako czynnik immunomodulujący). Wynik analizy można wykorzystać na wiele sposobów, m.in. do uzyskania optymalnego składu badanego terapeutyku do danego schorzenia).

Usługa polega na dokonaniu szczegółowej charakterystyki wyizolowanych komórek multipotentnych. W ramach usługi będą określone wartości poniższych parametrów:

1. Liczba komórek żywych
2. Odzysk komórek żywych w przypadku przesłania zamrożonej próbki
3. Żywotność komórek
4. Morfologia komórek
5. Markery komórek MSC wg ISCT (ang. International Society for Cell Therapy).
6. Poziom ekspresji białek charakterystycznych dla właściwości przeciwzapalnych i immunomodulacyjnych (wybrane geny)
7. Poziom ekspresji białek charakterystycznych dla właściwości wspomagania regeneracji (wybrane geny)
8. Określenie w w hodowli in vitro potencjału komórek do różnicowania  komórki tkanki kostnej (potencjał osteogenny), komórki tkanki tłuszczowej (potencjał adipogenny) i komórki tkanki chrzęstnej (potencjał chondrogenny)

Opcjonalnie, możliwa jest też izolacja komórek multipotentnych z tkanki. 

Usługę pomiaru białka całkowitego realizujemy za pomocą zestawu Pierce™ BCA Protein Assay Kit. Na pojedynczą usługę składa się pomiar maksymalnie 38 prób, zawsze w dwóch powtórzeniach technicznych. Ogólna zasada polega na połączeniu dobrze znanej redukcji Cu²⁺ do Cu¹⁺ przez białko w środowisku zasadowym z bardzo czułym i selektywnym wykrywaniem kolorymetrycznym kationu miedziawego (Cu¹⁺) kwasem bicynchoninowym (BCA). Pomiar Absorbancji wykonywany jest na czytniku płytek Spark firmy Tecan, natomiast wyniki udostępniane w formacie programu Excel do własnej analizy.

W naszym laboratorium oferujemy usługę pomiaru żywotności komórek różnego typu. Dysponujemy najlepszymi dostępnymi na rynku oraz sprawdzonymi odczynnikami. Pomiary wykonujemy dla 47 prób, zawsze w dwóch powtórzeniach technicznych dla badanej próbki. Dzięki zastosowaniu odczynnika PrestoBlue™ Cell Viability Reagent , który z łatwością jest metabolizowany przez żywe komórki, odczyt możemy wykonywać już po 10 minutach inkubacji. Pomiar fluorescencji wykonywany jest za pomocą zaawansowanego czytnika płytek Spark firmy Tecan natomiast wyniki eksportowane w programie Excel, w którym zawarte są szczegółowe informacje dotyczące odczytu, od czasu pomiaru po dokładne ustawienia fluorescencji i pozycji próbek.

Oferujemy również najszybszą technikę pozwalającą na stworzenie dokładnego profilu białkowego badanej próbki z jednoczesnym zachowaniem wysokiej dokładności i powtarzalności pomiarów, a to wszystko z wykorzystaniem systemu Luminex Magpix. Usługę wykonujemy w zależności od indywidualnych potrzeb Klienta, który sam komponuje sobie kompletny zestaw markerów. W jednorazowej usłudze możemy stworzyć kompletny białkowy profil dla około 35 badanych prób. System przed każdorazową usługą jest kalibrowany oraz weryfikowany, a obsługą sprzętu zajmują się wyłącznie osoby wykwalifikowane. Czas trwania kompletnej usługi to 9,5 godziny. Wyniki udostępnione w formacie programu Excel, zostają wstępnie omówione, a następnie przekazane Klientowi do dalszej analizy.

Technologia poklatkowej obserwacji mikroskopowej, tzw. „time-lapse” wychodzi naprzeciw potrzebie rejestracji w czasie rzeczywistym procesów biologicznych zachodzących w kulturach komórkowych. Posiadamy mikroskop Nikon Eclipse Ti-E, który jest wyposażony w nowoczesny system kontroli warunków otoczenia (komora klimatyczna z kontrolą temperatury, wilgotności i stężenia gazów), dzięki czemu zapewnia stabilne warunki do prowadzenia obserwacji sekwencyjnych w trakcie długotrwałych (kilkudniowych) doświadczeń komórkowych. Zautomatyzowany system pozwala na zaprogramowanie obserwacji w jasnym polu, kontraście fazowym oraz fluorescencji w układzie wielopunktowym – na szkiełkach mikroskopowych lub płytkach hodowlanych. Połączenie tych zaawansowanych technologii umożliwia przyżyciową obserwację komórek wybarwionych fluorescencyjnie, a także procesów ich adhezji i migracji w tzw. testach rysy. 
Oferowana usługa obejmuje przygotowanie i prowadzenie obserwacji, wraz z ciągłą obsługą i kontrolą hodowli i programu sterującego mikroskopem, zebranie oraz analizę otrzymanych danych w postaci zdjęć lub filmów poklatkowych. Usługę można poszerzyć o założenie hodowli komórkowej przeznaczonej do obserwacji mikroskopowej.

W zależności od potrzeb Klienta i rodzaju doświadczenia ustalane są:

• warunki hodowlane w komorze klimatycznej (temperatura, stężenie dwutlenku węgla i azotu),
• techniki obserwacji – jasne pole, kontrast fazowy, fluorescencja (dostępne filtry: niebieski, czerwony i zielony),
• powiększenie (dostępne obiektywy: 4x, 10x, 20x, 40x),
• odstępy czasowe między kolejnymi zdjęciami,
• liczba obserwowanych punktów.